用qSanger方法量化细菌培养物中的遗传变异

遗传变异，如突变、重组或转座，自然发生在培养的微生物中，通常被认为是非中性突变。

中性突变对生物体既无益也无害，只会影响总人口的一小部分。另一方面，非中性突变可以通过潜在地改变基因库来影响更大比例的人群，这取决于遗传变异提供的优点或缺点。这些突变可以使用不同的测序方法进行基因分型定量。

定量聚合酶链反应(qPCR)被认为是测量个体遗传变异的有效测序方法。然而，它可能既昂贵又耗时。相比之下，Sanger测序快速且具有成本效益，但其准确性在量化来自异质种群的质粒混合物中的突变方面存在不足。

由于环境条件的变化，中性突变可能成为主导，从而导致暂时选择或反选择，因此准确评估突变和野生型DNA序列的比率非常重要。此外，这种DNA量化可以改善疾病的早期诊断和有效的药物开发。因此，来自欧洲的一组研究人员设计了一种新方法——qSanger，用于量化遗传变异并识别中性/非中性突变。

“我们研究中提出的qSanger方法使用来自Sanger测序的数据来测量细菌培养物中遗传变异的比率，”隶属于华威大学和基尔大学的AlfonsoJaramillo教授说，他是该论文的通讯作者。学习。

该研究发表在BioDesignResearch上。

首先，该团队使用了大肠杆菌(E.coli)的Top10感受态细胞，这些细胞是在抗生素存在的情况下进行有氧培养的。细菌菌落与两种质粒——P1和P2共转化。接下来，他们使用Sanger测序为与P1和P2共转化的细菌菌落生成具有多条迹线的电泳图。这两个质粒也分别进行了测序。

此后，P1和P2序列的轨迹与混合的P1:P2轨迹对齐。最后，他们应用qSanger方法对质粒DNA进行量化，使用来自混合Sanger测序读数的对齐电泳图峰的振幅比。

为了轻松测量质粒比率，该团队使用了具有两种质粒构建体的不同荧光标记——P1质粒中的mCherry(红色)和P2质粒中的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。这些表达荧光的质粒还有助于使用标准DNA定量方法在体外和共转化细菌中验证qSanger方法。

首先，他们通过测量仅P1和P2细胞的不同混合物中的质粒DNA比率来验证qSanger方法。接下来，该团队使用qPCR和荧光定量评估了共转化大肠杆菌细胞中的P1:P2比率。在这两种情况下，使用qSanger方法计算的P1:P2比率与其他质粒DNA比率相关。

这些结果证明了qSanger方法在量化来自混合Sanger序列的细胞中的遗传变异方面的准确性，证明其功效可与其他DNA量化方法相媲美。然而，使这种方法与qPCR和数字微滴PCR等技术脱颖而出的是它的易用性以及显着降低的成本和劳动力。

在讨论这种新方法的潜在应用时，Jaramillo教授说，“我们的方法可用于分析基因编辑的不同实施后细胞群中的突变体/非突变体DNA比率，包括碱基编辑、引物编辑和多重自动化启动子工程基因组工程。此外，它还可用于需要对同一混合物中的多个DNA或RNA序列进行量化的应用。”

鉴于DNA测序在不同领域的应用越来越多，qSanger方法可能会突破准确、省时和具有成本效益的DNA评估的极限。

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